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Chemie und Mikrobiologie des Weines

By Julie Wood,2014-06-01 15:51
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Chemie und Mikrobiologie des Weines

Chemie und Mikrobiologie des Weines, Übungsteil „Mikrobiologie“

Membranfiltration

    Die Membranfiltration dient zur mikrobiologisch-hygienischen Überprüfung keimarmer flüssiger Proben. In der Weinwirtschaft wird sie hauptsächlich zur Kontrolle während der Weinabfüllung und zur Kontroller der mikrobiologischen Stabilität verwendet. Es kann die mikrobiologische Entwicklung eines Weines oder die Effizienz eines Stabilisationsverfahrens verfolgt werden

    Als Grenzwerte gelten für Süßwein < 10 Zellen/L, für trockenen Wein < 100 Zellen/L, abhängig von Restzuckergehalt, BSA, pH, Alkoholgrad, Weinstil. Um statistische abgesicherte Resultate zu bekommen, sollten sich auf dem Membranfilter 20 200 Kolonien entwickeln.

    Materialien: Membranfiltrationsgerät, hitzesterilisierbar, bestehend aus

    Trichteraufsatz und Unterteil

    Saugflasche mit Vakuumschlauch

    Vakuumpumpe, z.B. Wasserstrahlpumpe

    Membranfilter, steril

    Kulturschalen (Petrischalen) mit Nährkartonscheiben (NKS)

    Bunsenbrenner

    Pipetten

    Pinzette aus Edelstahl

    Alkohol 70% zum desinfizieren

    Steriles Wasser

    Brutschrank

Durchführung:

    o vor jedem Gebrauch Trichteraufsatz und Unterteil mit Ethanol desinfizieren und

    anschließend mit der Flamme des Bunsenbrenners etwa 20 s lang abflammen o 30 Minuten abkühlen lassen

    o NKS vorbereiten: mit ca. 3,5 ml sterilem Wasser NKS benetzen o um das Einlegen des Membranfilters zu erleichtern, etwas steriles Wasser in den

    Filteraufsatz leeren und absaugen

    o Membranfilter mit abgeflammter Pinzette aus der Verpackung nehmen, Klammer

    öffnen, Filter mit Schutzplättchen luftblasenfrei auf die Fritte legen,

    Schutzplättchen entfernen, Klammer schließen

    o Probe steril einfüllen und absaugen (Probengefäß zuvor mit Alkohol abreiben,

    Flaschenhals abflammen)

    o Innenwände des Trichters mit sterilem Wasser abspülen und absaugen (nach

    dem Absaugen darf sich kein Wasser auf dem Membranfilter befinden) o Klammer öffnen, Membranfilter mit steriler Pinzette luftblasenfrei auf die

    Oberfläche der NKS legen

    o Petrischale 2 3 Tage bei 25 - 30?C im Brutschrank bebrüten

    o Filtergerät hitzesterilisieren (wie oben)

    o nach Bebrütung: Auszählen der Keime, Optimum 20 200 Keime pro Filter

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Biologischer Säureabbau

    Es gibt mehrere Möglichkeiten für die Kontrolle des Biologischen Säureabbaus (BSA): Dünnschicht- oder Papierchromatographie, enzymatische Bestimmung, sensorische Veränderung des Weines, Gas- und Trübungsbildung.

    Die Dünnschichtchromatographie liefert eine qualitative (eventuell semiquantitative) Aussage. Sie basiert auf den Wechselwirkungen zwischen stationärer Phase, mobiler Phase (Laufmittel) und der Probe. Die organischen Säuren werden aufgrund ihrer Affinität zur mobilen Phase mitgezogen, die Auftrennung erfolgt über die Molekülgröße und die Anzahl der Hydroxidgruppen. Durch einen Säureindikator erscheinen die Säuren als gelbe Flecken auf blauem Hintergrund.

    Die Identifizierung erfolgt durch den Retentionsfaktor R. f

Materialien und Durchführung: Die DC-Chromatographie wird mit dem „Weinset“ der

    Firma Macherey-Nagel durchgeführt, Anleitung dazu siehe Beilage „Weinset“

    Pro DC-Platte werden zwei Proben und die Standardlösung aufgetragen. Zellzahlbestimmung mittels Thomakammer

    Die Thomakammer ist ein plangeschliffener Objektträger mit einer oder zwei Zählflächen und einer Netzeinteilung. Das Netzquadrat ist in 16 (oder 25) Groß- und 2400 Kleinquadrate unterteilt. Die Fläche beträgt 1 mm, die Tiefe 0,1 mm. Daraus 3resultiert ein Volumen von 0,1 mm bzw. 0,1 µl.

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Mit der Thomakammer ist eine rasche Bestimmung möglich; um ein repräsentatives 6 Zellen/ml notwendig. Ergebnis zu erhalten, sind allerdings mindestens 10

    Die Suspension soll so konzentriert sein, dass pro Kleinquadrat maximal 5 - 6 Zellen gezählt werden.

    Materialien: Thomakammer mit Deckglas

    Lichtmikroskop

    Pipette, Alkohol

    Durchführung:

    o Seitenstege mit Alkohol befeuchten und durch leichtes Hin- und Herbewegen

    fixieren

    o Mischen der Zellsuspension

    o einen Tropfen Zellsuspension mit Pipette zwischen Deckglas und Zählkammer

    positionieren (die Kammer wird durch einwirkende Kapillarkräfte gefüllt) o Auszählen einer repräsentativen Anzahl von Großquadraten

    o Reinigen der Thomakammer und des Deckglases

Berechnung:

    Gesamtzellzahl pro ml Ausgangssuspension =

    ausgezenZellenAnzahlderlt4 40010potentiellerVerdnungsfaktor;;;AnzahlderltausgezenKleinquadrate

    Anmerkungen: Eine Lebendzellzahlbestimmung ist durch Zugabe von Methylenblau möglich (mischen von 1 ml Methylenblau pH 4.6 mit 1 ml Hefensuspension in einer Eprouvette, 5 min warten). Der Farbstoff kann durch die Zellwände nicht mehr aktiver Hefen diffundieren, diese erscheinen in der Folge im Mikroskop blau. Die Zellen müssen innerhalb von 30 Minuten ausgezählt werden.

    Andere Methoden zur Zellzahl- bzw. Keimzahlbestimmung:

    Koch’sches Plattengussverfahren, Most Probable Number, Membranfiltration, Trübungsmessung, molekularbiologische Methoden

    Lichtmikroskopische Identifizierung von Hefen und Bakterien Herstellung eines Nasspräparates:

    Material: Lichtmikroskop

    Objektträger; Deckgläser; Immersionsöl; Impföse

    Destilliertes Wasser; Bunsenbrenner;

    Reinkulturen von Hefen, Bakterien, Schimmelpilzen

    o auf einen Objektträger einen Tropfen Wasser aufbringen

    o Kultur mit einer abgeflammter Impföse entnehmen und im Wassertropfen

    suspendieren

    o Deckglas luftblasenfrei auflegen

    o mit dem 10x Objektiv Gesichtsfeld suchen

    o mit 40x Hefen, 100x (Immersionsöl!) Bakterien mikroskopieren

Makroskopische Beobachtungen

    Kolonieform, Farbe, Konsistenz, Größe

Mikroskopische Beobachtungen

    Zellform, Größe, vegetative Vermehrungsform

    Bei Schimmelpilzen

    Farbe, Art der Sporenbildung, Unterscheidung Gießkannen- und Pinselschimmel

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