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PCR Quantitative

By Bradley Cooper,2014-12-23 21:11
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PCR Quantitative

    Protocole

    PCR Quantitative

    ?

    ABI PRISM 7000 Sequence

    Detection System

    Applied

    Biosystems

    ?Protocole PCR Quantitative ABI PRISM Sequence Detection System

    Sommaire

I Introduction: ............................................................................................... 3

1- Description et principe de l‟ABI PRISM 7000: ...............................................................3

    2- Description du SYBR Green Master Mix : ......................................................................6 3- Prévention pour la contamination et l‟amplification non spécifique : ................................6

    II - Préparation de la PCR : ................................................................................... 9

1- Dilution des primers : ......................................................................................................9

    2- Préparation du mix :........................................................................................................9

    III - Utilisation de la machine : ............................................................................. 12

    1- Mise en route de l‟appareil : .......................................................................................... 12 2- Création d‟un nouveau fichier : ..................................................................................... 12 3- Préparation de la plaque : .............................................................................................. 13

    4- Conditions de températures : ......................................................................................... 14 5- Sauvegarde du fichier : ................................................................................................. 15

    6- Lancement de la PCR : ................................................................................................. 15 IV - Analyse et enregistrement des données : .......................................................... 16

1- Amplification Plot : ....................................................................................................... 16

    3- Visualisation des résultats : ........................................................................................... 16

    4- Courbes de dissociation : .............................................................................................. 17 5- Exportation des résultats : ............................................................................................. 19

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    ?Protocole PCR Quantitative ABI PRISM Sequence Detection System

    I Introduction:

    1- Description et principe de l’ABI PRISM 7000:

L‟ABI PRISM 7000 Sequence Detection System est employé pour déterminer la quantité

    d'une séquence d'acides nucléiques cible dans un échantillon en analysant les modifications cycle par cycle du signal de fluorescence conséquent à l'amplification lors de la PCR.

Sécurité

    Pour les consignes de sécurité, référez-vous à la section Safety ” du guide d‟utilisation de

    l‟ABI PRISM 7000 Sequence Detection System, P/N 4330228 (placée en annexe de ce document). Suivez les consignes de sécurité lorsque vous utilisez cet instrument.

La chimie fluorescente :

    Le SYBR Green Double-Stranded Binding Dye est utilisé pour la détection fluorescente d‟ADN double brin (dsDNA) générée lors de la PCR. Le SYBR Green se fixe de façon non spécifique sur le dsDNA et génère un profil d‟exitation-emission similaire au FAM reporter dye.

    Le SYBR Green couplé à une référence passive (le ROX) est employé sur l‟ABI PRISM 7000 couplé au logiciel SDS (Sequence Detection System) pour réaliser des expériences de PCR quantitative suivies de courbes de dissociation. La figure suivante illustre l‟action du SYBR Green durant un cycle de PCR.

     1:1:1:Quand il est ajoutéàla réaction, le SYBR Green 1 Dyese lie deQuand il est ajoutéàla réaction, le SYBR Green 1 Dyese lie deQuand il est ajoutéàla réaction, le SYBR Green 1 Dyese lie de3:3:3:Lors de la phase dLors de la phase dLors de la phase d‟é‟é‟élongation, le SYBR Green commence a selongation, le SYBR Green commence a selongation, le SYBR Green commence a se façon non spécifique àlfaçon non spécifique àlfaçon non spécifique àlADN double brin et devient fluorescent.ADN double brin et devient fluorescent.ADN double brin et devient fluorescent.lier aux produits de PCR.lier aux produits de PCR.lier aux produits de PCR.

2:2:2:Lors de la dénaturation de lLors de la dénaturation de lLors de la dénaturation de lADNleSYBR Green est libéré. ParADNleSYBR Green est libéré. ParADNleSYBR Green est libéré. Par4:4:A la fin du cycle, la polymérisation est complète et le SYBRA la fin du cycle, la polymérisation est complète et le SYBR conséquent, la fluorescence diminue.conséquent, la fluorescence diminue.conséquent, la fluorescence diminue.Green est complètement liéinduisant ainsi une augmentationGreen est complètement liéinduisant ainsi une augmentation nette de la fluorescence.nette de la fluorescence.

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    ?Protocole PCR Quantitative ABI PRISM Sequence Detection System

Détection de la fluorescence et collection des données :

    Durant la PCR, la lumière d‟une lampe tungsten-halogen est focalisée simultanément sur

    chaque puit de la microplaque. La lumière passe à travers l‟ouverture de chaque puit et excite

    les fluorochromes présents dans la solution (SYBR Green et Rox). Il en résulte l‟émission de fluorescence entre 500 et 660 nm collectée pour chaque puit durant la phase d‟élongation de la réaction de PCR. Un système de lentilles, de filtres et de miroirs dichroïques permet de focaliser la fluorescence émise sur la caméra CCD (charge-coupled device). Les 4 filtres séparent la lumière émise (selon la longueur d‟onde) selon un schéma spatiale prévisible jusque la caméra CCD. Le logiciel 7000 collecte les signaux fluorescents à partir de la caméra CCD et applique aux données une analyse algorithmique.

Analyse des données de PCR Quantitative :

    L‟analyse des données de PCR en temps réel nécessite plusieurs modifications post acquisition pour donner un sens au signal de fluorescence émis à chaque cycle de PCR.

    Le system 7000 peut être utilisé pour la quantification absolue ou relative d‟une séquence d‟acides nucléiques par analyse cycle par cycle des modifications du signal de fluorescence qui

    résultent de l‟amplification lors de la PCR. Cette forme d‟analyse de PCR quantitative, appelée analyse cinétique ” a d‟abord été décrite en utilisant un dye fluorescent non spécifique, le BET, pour détecter les produits de PCR amplifiés (Higuchi, et al., 1992 ; Higuchi, et al., 1993). Plus le nombre de cycles pour atteindre le niveau détectable de fluorescent est faible, plus la quantité d‟ADN de départ est importante.

Lorsque la fluorescence est représentée sur un graphe en échelle logarithmique, l‟amplification

    normale d‟un produit de PCR génère des courbes similaires à celles représentées ci dessous. Il y a 3 régions distinctes qui caractérisent la progression de la PCR.