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PCR Quantitative

By Bradley Cooper,2014-12-23 21:11
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PCR Quantitative

    Protocole

    PCR Quantitative

    ?

    ABI PRISM 7000 Sequence

    Detection System

    Applied

    Biosystems

    ?Protocole PCR Quantitative ABI PRISM Sequence Detection System

    Sommaire

I Introduction: ............................................................................................... 3

1- Description et principe de l‟ABI PRISM 7000: ...............................................................3

    2- Description du SYBR Green Master Mix : ......................................................................6 3- Prévention pour la contamination et l‟amplification non spécifique : ................................6

    II - Préparation de la PCR : ................................................................................... 9

1- Dilution des primers : ......................................................................................................9

    2- Préparation du mix :........................................................................................................9

    III - Utilisation de la machine : ............................................................................. 12

    1- Mise en route de l‟appareil : .......................................................................................... 12 2- Création d‟un nouveau fichier : ..................................................................................... 12 3- Préparation de la plaque : .............................................................................................. 13

    4- Conditions de températures : ......................................................................................... 14 5- Sauvegarde du fichier : ................................................................................................. 15

    6- Lancement de la PCR : ................................................................................................. 15 IV - Analyse et enregistrement des données : .......................................................... 16

1- Amplification Plot : ....................................................................................................... 16

    3- Visualisation des résultats : ........................................................................................... 16

    4- Courbes de dissociation : .............................................................................................. 17 5- Exportation des résultats : ............................................................................................. 19

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    ?Protocole PCR Quantitative ABI PRISM Sequence Detection System

    I Introduction:

    1- Description et principe de l’ABI PRISM 7000:

L‟ABI PRISM 7000 Sequence Detection System est employé pour déterminer la quantité

    d'une séquence d'acides nucléiques cible dans un échantillon en analysant les modifications cycle par cycle du signal de fluorescence conséquent à l'amplification lors de la PCR.

Sécurité

    Pour les consignes de sécurité, référez-vous à la section Safety ” du guide d‟utilisation de

    l‟ABI PRISM 7000 Sequence Detection System, P/N 4330228 (placée en annexe de ce document). Suivez les consignes de sécurité lorsque vous utilisez cet instrument.

La chimie fluorescente :

    Le SYBR Green Double-Stranded Binding Dye est utilisé pour la détection fluorescente d‟ADN double brin (dsDNA) générée lors de la PCR. Le SYBR Green se fixe de façon non spécifique sur le dsDNA et génère un profil d‟exitation-emission similaire au FAM reporter dye.

    Le SYBR Green couplé à une référence passive (le ROX) est employé sur l‟ABI PRISM 7000 couplé au logiciel SDS (Sequence Detection System) pour réaliser des expériences de PCR quantitative suivies de courbes de dissociation. La figure suivante illustre l‟action du SYBR Green durant un cycle de PCR.

     1:1:1:Quand il est ajoutéàla réaction, le SYBR Green 1 Dyese lie deQuand il est ajoutéàla réaction, le SYBR Green 1 Dyese lie deQuand il est ajoutéàla réaction, le SYBR Green 1 Dyese lie de3:3:3:Lors de la phase dLors de la phase dLors de la phase d‟é‟é‟élongation, le SYBR Green commence a selongation, le SYBR Green commence a selongation, le SYBR Green commence a se façon non spécifique àlfaçon non spécifique àlfaçon non spécifique àlADN double brin et devient fluorescent.ADN double brin et devient fluorescent.ADN double brin et devient fluorescent.lier aux produits de PCR.lier aux produits de PCR.lier aux produits de PCR.

2:2:2:Lors de la dénaturation de lLors de la dénaturation de lLors de la dénaturation de lADNleSYBR Green est libéré. ParADNleSYBR Green est libéré. ParADNleSYBR Green est libéré. Par4:4:A la fin du cycle, la polymérisation est complète et le SYBRA la fin du cycle, la polymérisation est complète et le SYBR conséquent, la fluorescence diminue.conséquent, la fluorescence diminue.conséquent, la fluorescence diminue.Green est complètement liéinduisant ainsi une augmentationGreen est complètement liéinduisant ainsi une augmentation nette de la fluorescence.nette de la fluorescence.

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Détection de la fluorescence et collection des données :

    Durant la PCR, la lumière d‟une lampe tungsten-halogen est focalisée simultanément sur

    chaque puit de la microplaque. La lumière passe à travers l‟ouverture de chaque puit et excite

    les fluorochromes présents dans la solution (SYBR Green et Rox). Il en résulte l‟émission de fluorescence entre 500 et 660 nm collectée pour chaque puit durant la phase d‟élongation de la réaction de PCR. Un système de lentilles, de filtres et de miroirs dichroïques permet de focaliser la fluorescence émise sur la caméra CCD (charge-coupled device). Les 4 filtres séparent la lumière émise (selon la longueur d‟onde) selon un schéma spatiale prévisible jusque la caméra CCD. Le logiciel 7000 collecte les signaux fluorescents à partir de la caméra CCD et applique aux données une analyse algorithmique.

Analyse des données de PCR Quantitative :

    L‟analyse des données de PCR en temps réel nécessite plusieurs modifications post acquisition pour donner un sens au signal de fluorescence émis à chaque cycle de PCR.

    Le system 7000 peut être utilisé pour la quantification absolue ou relative d‟une séquence d‟acides nucléiques par analyse cycle par cycle des modifications du signal de fluorescence qui

    résultent de l‟amplification lors de la PCR. Cette forme d‟analyse de PCR quantitative, appelée analyse cinétique ” a d‟abord été décrite en utilisant un dye fluorescent non spécifique, le BET, pour détecter les produits de PCR amplifiés (Higuchi, et al., 1992 ; Higuchi, et al., 1993). Plus le nombre de cycles pour atteindre le niveau détectable de fluorescent est faible, plus la quantité d‟ADN de départ est importante.

Lorsque la fluorescence est représentée sur un graphe en échelle logarithmique, l‟amplification

    normale d‟un produit de PCR génère des courbes similaires à celles représentées ci dessous. Il y a 3 régions distinctes qui caractérisent la progression de la PCR.

    Phase 3Phase 3

    Phase 2Phase 2

    Phase 1Phase 1

Phase 1 : Phase Exponentielle

    La phase de détection géométrique de haute précision est le point clé de la précision de l‟analyse des données de PCR quantitative. La phase géométrique est une gamme de cycle de

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    haute précision durant laquelle l‟efficacité de l‟amplification est importante et constante. Elle se produit après la première élévation détectable de la fluorescence et avant le début de la partie linéaire. Quand on trace une échelle logarithmique de la quantité d‟ADN en fonction du nombre de cycles, la courbe générée par la phase exponentielle donne approximativement une droite avec une pente. Le system 7000 a une sensibilité suffisante pour détecter au moins 3 cycles dans la phase exponentielle lorsque les conditions de PCR ont été optimisées.

Phase 2 : Phase Linéaire

    La phase linéaire est caractérisée par un effet de mise à niveau ou la pente de l‟amplification

    diminue de façon importante. A ce niveau, un ou plusieurs composants ne sont plus en concentration suffisante et l‟efficacité de l‟amplification commence à décroître. Cette phase est nommée “ linéaire ” car l‟amplification suit à peu près une progression arithmétique plutôt

    qu‟une augmentation géométrique. Comme l‟efficacité de l‟amplification diminue continuellement pendant cette phase, elle ne donne qu‟une faible précision.

Phase 3 : Phase Plateau

    Finalement, la courbe d‟amplification s‟achève par un plateau qui reste à peu près constant jusque la fin de la PCR.

Calcul du Ct

    Le logiciel SDS du system 7000 crée des liens quantifiables entre les échantillons basés sur le nombre de cycles écoulé entre 2 niveaux détectables de fluorescence. Les échantillons contenant une plus grande quantité de matériel coupent le seuil de détection a un nombre de cycle plus faible que les échantillons contenant moins de matériel. Le logiciel utilise un seuil de détection pour définir le cycle d‟amplification permettant d‟atteindre un niveau de fluorescence donné.

Le cycle qu‟on appelle Ct (cycle threshold) pour une courbe d‟amplification donnée

    correspond au nombre de cycles nécessaire pour que la courbe d‟amplification croise le seuil

    de détection. Le Ct dépend de 2 facteurs : - le nombre de copies de départ

     - l‟efficacité de l‟amplification de la PCR

    Pour déterminer le Ct, le logiciel utilise les données collectées à partir d‟un niveau prédéfini qu‟on appelle la ligne de base (base line) dont les valeurs par défaut sont comprises entre le èmeème3 et le 15 cycle). Dans un premier temps, le logiciel calcule une tendance mathématique qui utilise le nombre de cycles de la ligne de base, les valeurs Rn, pour générer une ligne de base soustraite à l‟amplification (;Rn sur l‟axe des ordonnées). Alors, un algorithme recherche

    le point sur la courbe d‟amplification qui coupe le seuil de détection par défaut. Le cycle correspondant est appelé le Ct.

    Note : Il peut être nécessaire d‟ajuster la ligne de base et le seuil de détection pour obtenir des valeurs plus précises.

Signification du Ct :

    En prenant l‟équation décrivant la phase exponentielle de la PCR :

     n-m X = X(1+E)nmX

    

    X = nombre de copies de la séquence à n cycles (nm) n

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    X = nombre de copies de la séquence à m cycles m

    E = efficacité de l‟amplification (comprise entre 0 et 1) X

Si l‟efficacité de la PCR est de 100%, alors E= 1 alors Xn-mX = X(1+1) nmn-m = X(2) m

    Alors, chaque cycle de réaction de PCR correspond à une augmentation de 2 fois du produit de PCR. De ce fait, une différence d‟un cycle entre 2 échantillons signifie qu‟un des échantillons contient 2 fois plus de matériel que l‟autre.

    2- Description du SYBR Green Master Mix :

    Le SYBR Green PCR Master Mix utilisé (SYBR Green PCR Master Mix, Applied Biosystems, Part Number 4309155) est à une concentration 2X et contient suffisamment de réactifs pour réaliser 400 réactions à 25 µL final. Le mix est optimisé pour les réactions SYBR Green et contient du fluorochrome SYBR Green, de l‟AmpliTaq Gold? DNA Polymerase, des dNTPs

    avec du dUTP, une référence passive (ROX) et un tampon optimisé pour tous ces composants.

Sécurité Chimique :

     Le SYBR Green peut causer des irritations des yeux, de la peau et du tractus respiratoire. Il peut aisément être absorbé par la peau et est inflammable sous forme liquide et gazeuse (tenir éloigner d‟une flamme). Ce produit contient un réactif qui peut causer des dommages au foie et au sang.

Lisez les MSDS et suivez les instructions avant de l’utiliser. Porter des lunettes de

    protection, une blouse et des gants.

    http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/00100859.pdf

Storage and Stability

    Après réception, conserver le SYBR Green Master Mix entre 2 et 8 ?C (dans la chambre froide en salle d‟histologie dans le tiroir du bas à gauche près de la porte). Si il est stocké dans des conditions autres que celles recommandées, ses performances peuvent être altérées par rapport à celles données par Applied Biosystems. Pour une bonne gestion des stocks, utiliser les flacons de Sybr green dans l‟ordre décroissant. Une fois ouvert, les flacons sont stockés dans le réfrigérateur de la salle de Q PCR.

    3- Prévention pour la contamination et l’amplification non spécifique :

L‟amplification d‟ADN par PCR nécessite des pratiques de laboratoire spéciales. Une

    contamination potentielle peut-être introduite par des échantillons contenant des hautes concentrations en ADN, en ADNc ou par PCR croisées. De plus, la nature de détection non-spécifique du SYBR Green qui se lie à tout ADN double brin, augmente les risques de contamination. Il est donc recommandé de vérifier la formation d‟amplicons non-spécifiques en

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    réalisant des courbes de dissociations à la fin de chaque run et par une analyse sur gel d‟agarose (Voir protocole pages 13 et 14).

Hot Start PCR

    Pour augmenter la spécificité et la sensibilité de la PCR en contrôlant les événements précoces, la technique de Hot Start PCR a été introduite (Faloona et al., 1990).

    La Hot Start PCR est une simple modification du procédé original de la PCR dans lequel la réaction d‟amplification débute à partir d‟une température élevée. Ceci a initialement été réalisé manuellement, par addition d‟un composant essentiel à la réaction dans la solution lorsque à cette dernière a atteint une température élevée. Cependant cette approche est difficilement réalisable avec de nombreux échantillons. ?Applied Biosystems a introduit l‟AmpliTaq Gold DNA Polymerase pour réaliser de façon ?automatique, facile et efficace une Hot Start PCR. L‟AmpliTaq Gold DNA Polymerase est ?chimiquement modifiée a partir de l‟ AmpliTaq Gold DNA Polymerase. Cette modification

    rend l‟enzyme inactive en dessous d‟une température d‟activation. Une fois la température atteinte, le modifiant est relargué et l‟enzyme redevient active. Une étape d‟incubation à haute température est donc requise pour activer l‟enzyme et générer les ADN complètement ?dénaturés. Quand l‟AmpliTaq Gold DNA Polymerase est ajoutée à température ambiante, elle

    est donc incapable de faire l‟élongation des primers et limite ainsi les amplifications non

    spécifiques. Ceci permet entre autre de préparer les plaques de PCR quantitative jusqu‟à 24 h à l„avance et de les conserver ensuite à 4?c en attendant de les passer dans l‟ABI Prism 7000.

Faux Positifs

    Des pratiques spéciales sont nécessaires pour éviter les amplifications de faux positifs (Higuchi, et al., 1989). Ces derniers peuvent être générés par l‟amplification de l‟ADN simple brin au cours de la PCR (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1987; Saiki et al., 1988). En raison de

    l‟énorme amplification produite par la PCR, un amplicon non spécifique peut résulter d‟un échantillon contaminé. D‟autres contaminations peuvent provenir d‟échantillons avec de hautes concentrations d‟ADN ou à partir des échantillons positifs. Quand le dUTP remplace le dTTP

    comme substrat de la PCR et que la méthode décrite précédemment est utilisée, un traitement avec l‟AmpErase UNG peut prévenir les contaminations par la PCR précédente. Cette méthode utilise une réaction enzymatique et chimique analogue aux systèmes de restriction-modification et de réparation-excision des cellules et permet de dégrader spécifiquement les produits de PCR des PCR précédentes, les amplicons produits avant l‟activation spécifique de l‟enzyme mais sans dégrader les acides nucléiques et les ADNc de départ. La méthode pour rendre les produits de PCR susceptibles d‟être dégradés implique de substituer le dUTP au dTTP dans le mélange de PCR et le mix de PCR doit contenir l'enzyme uracil N-glycosylase (UNG, EC 3.2.2-) avant l‟amplification (Longo et al., 1990).

    L‟AmpErase UNG fournie dans ce produit est une enzyme pure, nuclease-free de 26-kDa codé

    par le gène uracil N-glycosylase d‟Escherichia coli qui a été inséré dans un vecteur

    d‟expression de E. coli pour obtenir la forme native de l‟enzyme (Higuchi et al., 1989). Bien

    que le protocole et les réactifs décrits ici soient capables de dégrader ou d'éliminer un grand nombre de produits non spécifiques de PCR, nous encourageons les utilisateurs à continuer d'utiliser les dispositifs et les suggestions décrits dans ce protocole et dans Kwok (1990) et Higuchi(1989) pour réduire au minimum la contamination croisée des produits non-spécifiques de PCR ou d'autres échantillons.

Utilisation optionnelle d’AmpErase UNG

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    Le traitement avec l‟AmpErase? uracil-N-glycosylase (UNG) peut être utile pour éviter les

    contaminations croisées des produits de PCR. Bien que le mélange ne contienne pas UNG, le dTTP a été remplacé par le dUTP, rendant ainsi le mélange compatible avec l'utilisation d'UNG. Si on suspecte une contamination croisée de PCR, l‟UNG devrait être employé pour résoudre le problème. UNG peut être acheté individuellement ou en tant qu'élément du kit SYBR? Green Core Reagents Kit (P/N 4304886).

Contaminants Fluorescents

    Puisque les contaminants fluorescents peuvent interférer dans les analyses du SYBR Green et donner des faux-positifs, il peut être nécessaire d‟inclure un échantillon contenant tous les réactifs mais pas d‟enzyme. Si la fluorescence absolue de l‟échantillon négatif est supérieure a celles des échantillons positifs, c‟est que les contaminants fluorescents peuvent être présents dans l'échantillon ou dans le bloc thermique de l‟appareil de PCR.

    Pratiques générales de PCR

    En préparant des échantillons pour l'amplification par PCR:

    - Portez une blouse de laboratoire propre (jamais portée lors de la manipulation de

    produits de PCR ou de la préparation des échantillons témoins) et des gants propres

    (changez les gants toutes les fois où vous suspectez qu'ils aient été souillés).

    - Maintenez séparés les secteurs, l'équipement et les approvisionnements consacrés à :

    a. La préparation des échantillons

    b. La préparation de la PCR

    c. L‟amplification de PCR

    d. L‟analyse des produits de PCR

    - N'introduisez jamais les produits de PCR amplifiés dans le secteur de préparation de

    PCR

    - Ouvrez et fermez tous les tubes témoin soigneusement. Essayez de ne pas éclabousser

    ou ne pas pulvériser des échantillons de PCR

    - Maintenez les réactions et les composants fermés autant que possible

    - Employez une pipette à déplacement positif ou des cônes à filtre.

    - Laver les paillasses et les équipements avec une solution d‟eau de Javel 10%

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    II - Préparation de la PCR :

Pour la préparation de la PCR, nous utilisons le mix SYBR Green (Applied Biosystems), et

    des primers synthétisés par Proligo et dilués à une concentration stock de 10 µM.

     1- Dilution des primers :

Les primers sont livrés sous forme très concentrée. Il faut donc les diluer à une concentration

    de 10µM. Pour cela mesurer tout d‟abord le volume contenu dans le tube.

    Puis avec la concentration connue fournie par le fabricant calculer le volume d‟eau à ajouter pour obtenir 10µM comme concentration finale.

En partant de la formule suivante :

    CiVi = CfVf

    Avec Ci = concentration initiale

     Vi = volume initial

     Cf = concentration finale

     Vf = volume final

    Le volume final correspond au volume initial additionné du volume ajouté (Va).

    Vf = Vi + Va

    donc

    CiVi/Cf = Vi + Va

    Va = CiVi/Cf Vi

    Va = Vi(Ci/Cf 1)

    Ajouter alors le volume calculé d‟eau Nuclease-free (Invitrogen) avec les pipettes rangées dans le tiroir du bas sous la paillasse coté mur.

     2- Préparation du mix :

Pour la préparation du mix, utiliser les pipettes placées dans le tiroir du bas sous la paillasse

    coté mur, les primers dilués à 10 µM, de l‟eau Nuclease-free et le SYBR Green Master Mix

    (dans la porte de réfrigérateur en salle de Q-PCR ou dans la salle d‟histologie cf. p4).

La feuille de calcul est accessible sur la base ProGeR-CDD (http://proger-cdd.crihan.fr) dans la

    Rubrique : Equipement, Material instructions, Quantitative Real Time PCR, Calcul Mix SYBR Green ou sur l‟ordinateur portable en salle de PCR Quantitative (en icône sur le Bureau :

    Calcul Mix SYBR Green).

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     Nombres de puits Volume final Volume de matrice Concentration du stock de primers Concentration finale des primers

     Volume de chaque réactif à ajourer pour la préparation du

     mix de PCR

    Placer une plaque 96 puits (96-Well Optical Reaction Plate, Applied Biosystems, Part Number 4306737) dans un portoir adapté (plaque et portoir sont rangés dans le placard de droite sous la paillasse coté fenêtre dans la salle de PCR Quantitative).

Attention :

    Ne pas poser la plaque directement sur la paillasse pour éviter la contaminer de votre

    plaque (ou de contaminer le bloc thermique de l‟appareil).

    Utiliser de préférence des gants non poudrés pour éviter de mettre du talc sur la plaque.

    Déposer alors 2,5µL si le volume final utilisé est de 12,5µL (ou 5µL si le volume finale utilisé est de 25µL) de produit de Reverse Transcription dans les puits. Puis ajouter les 10 µL de mix (ou 20µL).

    Une fois la plaque terminée, la sceller avec un couvercle en plastic adhésif optiquement neutre Applied Biosystems (Optical Adhesive Covers, Applied Biosystems, Part Number 4311971). Bien coller le couvercle avec la spatule en plastique.

Remarques :

    1- Comme matériel de départ, en général, nous utilisons des ADNc produits à

    partir d‟ARN messagers grâce au kit de Reverse Transcription Promega

    (Promega, ImProm-IITM Reverse Transcription System 100 réactions

    Cat#A3800). Mais il est aussi possible d‟utiliser de l‟ADN génomique comme

    matrice.

    2- Il faut noter qu‟on ne peut utiliser des produits de Reverse Transcription sans

    les diluer car cela va provoquer une diminution de l‟efficacité de la PCR.

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