DOC

PCR = = Polymerase Chain reaction

By Shane Austin,2014-12-23 20:54
9 views 0
PCR = = Polymerase Chain reaction

    ;

    Master Sciences

    Mention ? Microbiologie-Biologie Végétale et

    Biotechnologies ?

    Année 2009/2010

    Unité d’enseignement

    ? Initiation à la recherche en Microbiologie ?

    ;;;;;;;

    Fascicule de principes techniques

     1

    Avant-propos

     A titre d’exemples, certains protocoles sont explicités dans ce fascicule. Ceux-ci peuvent présenter de nombreuses variantes.

    METHODES D'OBSERVATION DES MICROORGANISMES

Bactériologie

     Il est possible d'observer les microorganismes

    - soit lorsqu'ils sont regroupés en colonies sur boîte visible à l’œil, il s'agit alors d'une observation macroscopique

    - soit à l'état de cellule, il s'agit alors d'une observation microscopique.

1 - Observation macroscopique des colonies

     C'est l'étude de l'aspect des colonies.

     Une colonie est l'amas, visible à l’œil nu, constitué par des milliards de descendants d'une seule cellule bactérienne et dont la taille, la forme, la couleur, la consistance sont caractéristiques de chaque espèce.

     L'étude de l'aspect des colonies nécessite l'observation à l’œil nu, en lumière naturelle et

    artificielle, par éclairage direct et par transparence des colonies.

Conditions d'examen

    L'examen macroscopique des cultures est le premier examen effectué à partir de l'isolement après incubation . L'aspect des colonies dépend du milieu utilisé, de la durée et de la température de l'incubation . Il ne pourra être décrit convenablement qu'à partir de colonies bien isolées : les colonies sont d'autant plus petites qu'elles sont rapprochées.

    Les colonies sont observées par transparence, réflexion ou transillumination oblique.

     2

Aspect

La description des colonies doit mentionner

1 : La taille ou le diamètre de la colonie

    Elle peut être mesurée à l'aide d'une règle graduée pour les grandes colonies.

2 : La forme

     - allure des contours

     lisses, dentelés, déchiquetés

     réguliers, irréguliers

     - relief

     surface bombée, demi-bombée, plate

     centre parfois surélevé, parfois ombiliqué (en creux)

3 : L'aspect de la surface

    Il peut être lisse ou rugueux,

4 : L'opacité

    Les colonies sont décrites comme

    - opaques (ne laissent pas passer la lumière)

    - translucides (laissent passer la lumière mais on ne voit pas les formes au travers, comme le verre dépoli)

    - transparentes (laissent passer la lumière et voir les formes au travers, comme le verre)

5 : La consistance

    Au moment du prélèvement il est possible d'apprécier si les colonies sont grasses, crémeuses (on obtient facilement des suspensions homogènes), sèches ou encore muqueuses (on obtient difficilement des suspensions homogènes).

6 : La couleur (pigmentation)

    Les colonies habituelles sont crème. Une couleur différente est due à des pigments : jaune, rouge, orange, violette ...

Principaux types

    En rassemblant les critères précédemment décrits, trois sortes de colonies peuvent être distinguées

    - colonies S (de l'anglais Smooth - Lisse) : colonies à surface lisse et bords réguliers, bombées, de consistance crémeuse et donnant des suspensions homogènes

- colonies R (de l'anglais Rough - Rugueux) : colonies à surface rugueuse et bords dentelés,

    plates, de consistance sèche et donnant des suspensions hétérogènes

     3

    - colonies M (= Muqueuse) : colonies à surface lisse et bords réguliers, bombées, filantes sous l'anse, et donnant des suspensions hétérogènes.

7 : Odeur

     - une odeur caractéristique peut être présente

2 - Observation microscopique

     L'observation microscopique permet de faire une étude morphologique des cellules d'une espèce microbienne.

    Elle comprend

     l'examen à l'état frais (examen entre lame et lamelle des bactéries vivantes)

     l'examen après coloration (le plus souvent sur frottis séchés et fixés).

    2.1 - Examen à l'état frais

     Il permet d'observer sur les cellules vivantes:

    - la forme des cellules

    - leur mode de groupement

    - leur mobilité

    - la quantité approximative des bactéries par champ microscopique

     * Forme des cellules

     Ce caractère est très important en bactériologie, il peut à lui seul conduire à la détermination de genre mais on doit l'utiliser avec une extrême prudence. C'est ainsi qu'on différencie des germes ayant :

     - une forme sphérique : les cocci (ordres de Micrococcales)

     - une forme allongée en bâtonnet : les bacilles (ordre des Bacteriales)

     - une forme intermédiaire : les cocobacilles

     - une forme incurvée en virgule (vibrio) ou en ondulation (ordre des Spirillales)

     - une forme spiralée (ordre des Spirochaetales)

     - une forme ramifiée (ordre des Actinobactériales).

    Attention l'examen est effectué à travers une certaine épaisseur de liquide, des bactéries identiques pourront apparaître sous des angles divers et sembler différentes.

     A côté de la forme elle-même des bactéries, l'étude des groupements retrouvés dans les

    cultures et qui sont liés au mode de division des germes vient compléter les données morphologiques et fournir de précieuses informations pour l'identification . Ainsi dans l'ordre des Micrococcales, les différents groupements observés sont caractéristiques d'un genre donné:

    - groupement par deux en diplocoques:

    + genre Pneumococcus pour les cocci Gram

    - genre Neisseria pour les cocci Gram

    - groupement en chainettes:

     4

     genres