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PCR = = Polymerase Chain reaction

By Shane Austin,2014-12-23 20:54
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PCR = = Polymerase Chain reaction

    ;

    Master Sciences

    Mention ? Microbiologie-Biologie Végétale et

    Biotechnologies ?

    Année 2009/2010

    Unité d’enseignement

    ? Initiation à la recherche en Microbiologie ?

    ;;;;;;;

    Fascicule de principes techniques

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    Avant-propos

     A titre d’exemples, certains protocoles sont explicités dans ce fascicule. Ceux-ci peuvent présenter de nombreuses variantes.

    METHODES D'OBSERVATION DES MICROORGANISMES

Bactériologie

     Il est possible d'observer les microorganismes

    - soit lorsqu'ils sont regroupés en colonies sur boîte visible à l’œil, il s'agit alors d'une observation macroscopique

    - soit à l'état de cellule, il s'agit alors d'une observation microscopique.

1 - Observation macroscopique des colonies

     C'est l'étude de l'aspect des colonies.

     Une colonie est l'amas, visible à l’œil nu, constitué par des milliards de descendants d'une seule cellule bactérienne et dont la taille, la forme, la couleur, la consistance sont caractéristiques de chaque espèce.

     L'étude de l'aspect des colonies nécessite l'observation à l’œil nu, en lumière naturelle et

    artificielle, par éclairage direct et par transparence des colonies.

Conditions d'examen

    L'examen macroscopique des cultures est le premier examen effectué à partir de l'isolement après incubation . L'aspect des colonies dépend du milieu utilisé, de la durée et de la température de l'incubation . Il ne pourra être décrit convenablement qu'à partir de colonies bien isolées : les colonies sont d'autant plus petites qu'elles sont rapprochées.

    Les colonies sont observées par transparence, réflexion ou transillumination oblique.

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Aspect

La description des colonies doit mentionner

1 : La taille ou le diamètre de la colonie

    Elle peut être mesurée à l'aide d'une règle graduée pour les grandes colonies.

2 : La forme

     - allure des contours

     lisses, dentelés, déchiquetés

     réguliers, irréguliers

     - relief

     surface bombée, demi-bombée, plate

     centre parfois surélevé, parfois ombiliqué (en creux)

3 : L'aspect de la surface

    Il peut être lisse ou rugueux,

4 : L'opacité

    Les colonies sont décrites comme

    - opaques (ne laissent pas passer la lumière)

    - translucides (laissent passer la lumière mais on ne voit pas les formes au travers, comme le verre dépoli)

    - transparentes (laissent passer la lumière et voir les formes au travers, comme le verre)

5 : La consistance

    Au moment du prélèvement il est possible d'apprécier si les colonies sont grasses, crémeuses (on obtient facilement des suspensions homogènes), sèches ou encore muqueuses (on obtient difficilement des suspensions homogènes).

6 : La couleur (pigmentation)

    Les colonies habituelles sont crème. Une couleur différente est due à des pigments : jaune, rouge, orange, violette ...

Principaux types

    En rassemblant les critères précédemment décrits, trois sortes de colonies peuvent être distinguées

    - colonies S (de l'anglais Smooth - Lisse) : colonies à surface lisse et bords réguliers, bombées, de consistance crémeuse et donnant des suspensions homogènes

- colonies R (de l'anglais Rough - Rugueux) : colonies à surface rugueuse et bords dentelés,

    plates, de consistance sèche et donnant des suspensions hétérogènes

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    - colonies M (= Muqueuse) : colonies à surface lisse et bords réguliers, bombées, filantes sous l'anse, et donnant des suspensions hétérogènes.

7 : Odeur

     - une odeur caractéristique peut être présente

2 - Observation microscopique

     L'observation microscopique permet de faire une étude morphologique des cellules d'une espèce microbienne.

    Elle comprend

     l'examen à l'état frais (examen entre lame et lamelle des bactéries vivantes)

     l'examen après coloration (le plus souvent sur frottis séchés et fixés).

    2.1 - Examen à l'état frais

     Il permet d'observer sur les cellules vivantes:

    - la forme des cellules

    - leur mode de groupement

    - leur mobilité

    - la quantité approximative des bactéries par champ microscopique

     * Forme des cellules

     Ce caractère est très important en bactériologie, il peut à lui seul conduire à la détermination de genre mais on doit l'utiliser avec une extrême prudence. C'est ainsi qu'on différencie des germes ayant :

     - une forme sphérique : les cocci (ordres de Micrococcales)

     - une forme allongée en bâtonnet : les bacilles (ordre des Bacteriales)

     - une forme intermédiaire : les cocobacilles

     - une forme incurvée en virgule (vibrio) ou en ondulation (ordre des Spirillales)

     - une forme spiralée (ordre des Spirochaetales)

     - une forme ramifiée (ordre des Actinobactériales).

    Attention l'examen est effectué à travers une certaine épaisseur de liquide, des bactéries identiques pourront apparaître sous des angles divers et sembler différentes.

     A côté de la forme elle-même des bactéries, l'étude des groupements retrouvés dans les

    cultures et qui sont liés au mode de division des germes vient compléter les données morphologiques et fournir de précieuses informations pour l'identification . Ainsi dans l'ordre des Micrococcales, les différents groupements observés sont caractéristiques d'un genre donné:

    - groupement par deux en diplocoques:

    + genre Pneumococcus pour les cocci Gram

    - genre Neisseria pour les cocci Gram

    - groupement en chainettes:

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     genres Streptococcus, Leuconostoc, Enterococcus

    - groupement en tétrades : genre Gaffkya

    - groupement en amas plans (grappe de raisin): genre Staphylococcus

    - groupement en amas non plans:

     amas cubiques: genre Sarcina

     amas irréguliers : genre Micrococcus

    - groupements en palissades ou en lettres (XVL): genres Corynebacterium et

    Cellulomonas.

     * Mobilité

     La mobilité est le caractère le plus important mis en évidence à l'état frais. On doit

    observer :

     - la présence ou l'absence de mobilité

     - les caractères de cette mobilité : frétillement des bactéries à ciliature polaire ou tournoiement des bactéries péritriches.

    Remarque: Une bactérie mobile doit se déplacer dans le champ microscopique avec un mouvement qui lui est propre, les autres bactéries restant immobiles ou se déplaçant dans d'autres directions. Attention cette mobilité ne doit pas être confondue avec les mouvements browniens qui sont des mouvements désordonnés de particules (sans déplacement véritable) dus à l'agitation thermique des molécules de liquide ni avec les mouvements transmis par les courants (toutes les bactéries sont entrainées dans la même sens).

     * Eléments particuliers de la bactérie

La capsule

     La présence d'une capsule est révélée à l'état frais de la souche cultivée sur milieu enrichi, par la coloration négative à l'encre de Chine. Sa mise en évidence est un indice important .

    +Ex : des diplocoques Gram entourés d'une capsule importante évoquent Streptococcus

    pneumoniae.

Les spores

     Leur présence permet à elle seule de ranger les bactéries aérobies dans la famille des Bacillaceae. De plus la spore et sa position permettent la classification des bactéries en groupes à l'intérieur d'une famille.

    2.2 - Examen après coloration

     Si la plupart des bactéries et des microbes peuvent être observés en suspension aqueuse, cette observation est grandement facilitée par l'application de colorants.

     Les colorations, réalisées sur des frottis séchés et fixés, sont classées en

     coloration simple (1 seul colorant)

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     coloration différentielle type Gram

     L’action de plusieurs colorants permet des effets de contraste: un premier colorant (cristal violet), un mordant qui complexe le colorant (lugol, acide phénique, acide chromique, chaleur), un différenciateur qui est une substance décolorante (alcool à 90?, mélange alcool/acétone, acides forts) et enfin un deuxième colorant .

     colorations spéciales

     des structures bactériennes (cils ou pili, capsules, spores ...)

La coloration de Gram

     C'est la coloration différentielle systématiquement réalisée lors d'un examen microscopique de bactéries.

     Elle permet non seulement d'observer la forme des cellules mais aussi de diviser les bactéries en deux grands groupes taxonomiquement différents:

    + - bactéries Gram-positives : Gram

    - - bactéries Gram-négatives : Gram

     Les bactéries qui retiennent le colorant basique utilisé (cristal-violet) après lavage à l'alcool sont dites Gram-positives, celles qui ne le retiennent pas sont dites Gram-négatives.

     Les bactéries Gram-négatives peuvent prendre la couleur d'un second colorant. Leur paroi ne présente pas de barrière de perméabilité à l'élution du complexe colorant-mordant par l'alcool.

    + La paroi des bactéries Gram est imperméable au complexe colorant-mordant, elles ne

    sont pas décolorées.

Procédure :

    - Préparer la lame et l'échantillon à examiner comme pour un état frais.

    - Etaler la suspension bactérienne en un film mince et régulier sur la lame avec une anse

    de platine par un mouvement régulier et circulaire (étalement de 2 à 3 cm de diamètre).

    - Laisser évaporer à sec soit à l'air libre, soit en tenant la lame bien au dessus de la

    flamme, le frottis doit devenir terne mais ne doit ni brunir, ni brûler.

    - L'étape de fixation qui suit consiste à tuer les bactéries, à rendre les membranes plus

    perméables, à fixer les structures sans les altérer et à faire adhérer le frottis à la lame.

    En tenant la lame avec une pince écraser trois fois la flamme avec la lame, le frottis est

    prêt à subir une coloration. (Il existe une technique plus délicate qui consiste à verser

    quelques gouttes d'alcool à 90?C sur la lame, laisser quelques secondes, égoutter et

    enflammer).

Coloration de Gram :

    - recouvrir le frottis fixé de cristal-violet, laisser agir une minute

    - laver l'excès de cristal violet avec quelques gouttes de Lugol; attendre 1mn

    - laver à l'eau et égoutter sur un mouchoir en papier.

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    - traiter la préparation avec de l'alcool à 95? (ou avec un mélange alcool/acétone) goutte à

    goutte jusqu'à ce que l'alcool ajouté n'entraîne plus de cristal-violet

    - recolorer avec la safranine pendant une minute (si le décolorant utilisé est un mélange

    alcool/acétone, ne colorer que 20 secondes avec la safranine)

    - laver, égoutter, sécher doucement la lame entre deux feuilles de papier Joseph.

    - Observer à l'immersion avec l'objectif ayant le plus fort grossissement sans contraste de

    phase (0 ou HF). Pour cela, déposer une goutte de liquide à immersion sur la lame,

    directement au contact du frottis. Ne pas utiliser de lamelle.

Champignons filamenteux

    Les champignons constituent un groupe d’organisme d'une extrême variété, des espèces microscopiques aux organismes de plusieurs kilos. Ils ont colonisé tous les milieux, terrestres ou aquatiques, et jouent un rôle primordial dans l'écologie de la planète en recyclant la matière organique morte.

    Les champignons présentaient déjà de grandes diversités à l'ère carbonifère. Ils sont parmi les plus anciennes formes ? végétales ? différenciées apparues sur le globe terrestre. Classés, initialement, parmi les végétaux à cause de la structure de leurs cellules, ils ne réalisent pourtant pas de photosynthèse.

    Ce groupe, dont les quelque 100 000 espèces se sont adaptées à des modes de vie très variés, est

    maintenant considéré comme un règne à part entière. Certains s'associent par symbiose à des

    algues pour survivre dans des conditions climatiques extrêmes, d'autres parasitent la peau de l'homme, quant aux saprophytes, ils provoquent la pourriture du bois.

     Ce sont des Eucaryotes.

    Ils sont hétérotrophes : ils ne peuvent pas, comme les plantes vertes, synthétiser la

    matière organique à partir du gaz carbonique atmosphérique et doivent donc puiser dans le milieu ambiant l'eau, les substances nutritives et les éléments minéraux nécessaires à la synthèse de leur propre matière. Ils les absorbent à travers la paroi de leur appareil végétatif. Sans véritables tissus, à l'inverse des plantes supérieures ou des animaux, leur appareil végétatif : le thalle ne comporte ni racine, ni tige, ni feuille. Le thalle peut être constitué d'une cellule unique, comme dans le cas de la levure de bière, ou plus souvent, d'une structure filamenteuse,

    ou mycélium. Le mycélium est non cloisonné chez les champignons inférieurs, et les filaments mycéliens, ou hyphes, peuvent être comparés à des cellules géantes. Chez les champignons supérieurs le mycélium est cloisonné, en effet les hyphes sont divisées en plusieurs segments contenant chacun un ou plusieurs noyaux.

    D’un point de vue structural les hyphes sont des sortes de tuyaux contenant le cytoplasme, les noyaux et autres organites cellulaires. Elles sont chez les champignons supérieurs cloisonnées. Dans les parties jeunes du mycélium les cloisons sont percées de pores qui permettent le passage du contenu cellulaire d'un compartiment à l'autre. Dans les parties les plus âgées, les cloisons sont fermées, isolant les parties en voie de dégénérescence des parties actives. Des septums assurent le cloisonnement des différents compartiment cellulaire (Fig1, Fig 2 et Fig3).

    La colonisation du susbstrat est réalisée par extension et ramification des hyphes. L'accroissement de celles-ci s'effectue par le sommet, ou apex, où s'effectue l'essentiel des

    réactions de synthèse et dégradation du métabolisme dit "primaire", indispensable à la construction de la cellule du champignon. Les régions apicales des hyphes sont caractérisées par

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    la présence de nombreuses vésicules cytoplasmiques contenant les enzymes et les précurseurs de synthèses de nouveaux polymères. Les produits du métabolisme "secondaire" non indispensable au fonctionnement de la cellule, sont plutôt stockés en région subapicale. Les métabolites secondaires les plus connus sont les pigments, les antibiotiques, les mycotoxines... Le mycélium croît et s'étend pour former un réseau à trois dimensions capable de s'organiser en structures complexes, tels que les chapeaux des champignons supérieurs. Le chapeau et le pied, partie visible du champignon, ne constituent que sa fructification (organe a reproducteur qui contient les spores produites au cours de la reproduction sexuée).

    Fig2 : Région apicale d’une hyphe Fig 4 : Une colonie :

Fig 3 : architecture d’une cellule fongique (ascomycètes, deutéromycètes)

    Le développement de l’hyphe se fait à partir d’une spore (sexuée ou asexuée) par

    émission d’un ou plusieurs tubes germinatifs et par croissance de la seule cellule terminale. La formation d’une colonie se fait de façon radiale à partir du point d'inoculation.

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    La complexité des cycles de reproduction sexuée ou asexuée est l'un des éléments qui ont entraîné la création d'un règne à part pour les champignons. La classification des espèces est d'ailleurs fondée sur ces particularités.

    La reproduction asexuée se réalise différemment selon l'espèce: par bourgeonnement

    chez la levure, par individualisation d'un des segments d'une hyphe ou par formation de spores asexuées.

     Fig 5 : Sporulation asexuée : A. niger et A. fumigatus

La reproduction sexuée nécessite la fusion de deux cellules spécialisées, ou gamètes.

    Les levures

    Les levures sont des champignons microscopiques unicellulaires (ou très faiblement pluricellulaires) qui se multiplient par bourgeonnement ou sporulation. Elles ont la capacité de fermenter des matières organiques, minérales ou végétales pour produire des substances variées. Les levures sont constituées par les espèces du genre Saccharomyces, agents de la fermentation alcoolique de la bière, du vin, du cidre, et des éléments actifs du levain de boulanger. C'est l'activité chimique des levures qui provoque le dégagement de bulles de gaz carbonique et fait lever la pâte à pain. Ces levures sont des cellules rondes ou ovales, qui, placées dans un milieu sucré ou glucidique, avec ou sans oxygène, se multiplient activement.

    Ces micro-organismes ont un diamètre compris entre 6 à 8 10 -6 m .

    Saccharomyces pompe : ce groupe se caractérise par son mode de division végétatif qui est transversal alors que les autres levures bourgeonnent. Elle a une forme rectangulaire. Saccharomyces cerevisiae. Au microscope, elle apparaît de formes arrondies ou ovoïdes.

     Bourgeon en formation

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    CROISSANCES BACTERIENNES

RAPPELS SUR L'ENERGETIQUE DE LA CROISSANCE

     La croissance peut être définie comme un accroissement ordonné de tous les composants d'un organisme. Chez les organismes unicellulaires, elle aboutit à une augmentation du nombre d'individus. Cette augmentation du nombre de cellules se traduit par une augmentation de la turbidité du milieu de culture. On peut admettre que lorsque la densité optique du milieu ne dépasse pas la valeur 0,6 (avec les spectros de TP) il y a proportionnalité entre le nombre d'individus présents dans la culture et la densité optique.

     Le développement d'une culture sera donc facilement représenté en traçant le graphique des densités optiques en fonction du temps : D.O. = f (t)

     En réalité, pour des raisons de précision, on tracera plutôt le graphique du log de la D.O. en fonction du temps sur papier semi-logarithmique.

     Au temps t on a x bactéries dans le milieu (inoculum) oo

     au temps t on a x bactéries dans le milieu

     Pendant l'intervalle de temps dt, l'accroissement du nombre de cellules de la culture sera proportionnel à x

     Donc :dx/dt = µ.x (1) où: dx/x = µ.dt

     d'où : Ln x = µ . t + constante (2) Ln = log népérien

    Au temps t = o, on a x bactéries, donc : Ln x = constante (3) oo

De (2) et (3), on tire: Ln x = µ . t + Ln xo

     Ln x-Lx = µ . t o

     Ln x/x =µ . t o

    µt On passe en exponentielle : x/x = eo

    µtx = x. e soit : o (4)

     Si l'on considère que la masse unitaire des bactéries présentes dans la culture est constante, la relation (4) peut s'écrire :

    µt m = m . e (5) m = masse de l'inoculum oo

     Soit t le temps nécessaire à un doublement de la population (temps de génération). C'est le temps pour lequel on a : m = 2.m o

    µt µt Si l'on reporte cela dans (5), on a : 2 m= m e2 = e o o

     Donc : Ln 2 = µt . Ln e ( or Ln e = 1 )

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