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Regulation des Stoffwechsels

By Don Cruz,2014-07-18 21:14
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Regulation des Stoffwechselsdes

    Block III: Regulation des

    Stoffwechsels

    Bacillus subtilis Antibiotika und Sporulation

    Yvonne Voges und Melanie Thompson

Inhalt

     Einleitung ............................................................................................................. 1 I.

    II. Material und Methoden ........................................................................................ 9 III. Ergebnisse….. ................................................................................................ 10 IV. Diskussion ...................................................................................................... 32 V. Literatur .............................................................................................................. 44 VI. Anhang ........................................................................................................... 45

    I. Einleitung

    Bacillus subtilis ist ein stäbchenförmiges, Gram-positives Bakterium. Es wird zur Klasse der Bazillen und Clostridien zugeordnet, und weist dementsprechend einen niedrigen G+C-Gehalt auf. B. subtilis ist ubiquitär verbreitet und kann aus Böden,

    Wasser und auch Luft isoliert werden. Da in der Natur Nährstoffe nicht immer ausreichend vorhanden sind, treten beinah ständig wechselnd Stress- und Hungersituationen auf, hierbei kommen Bacillus subtilis zwei Eigenschaften besonders zu Gute: Zum einen ist er in der Lage antimikrobielle Substanzen zu produzieren. Diese werden ausgeschüttet und können schon in geringen Konzentrationen andere, um Nährstoffe konkurrierende Mikroorganismen im Wachstum hemmen. Antibiotika weisen verschiedenen Angriffsorte auf, so können die Zellwandbiosynthese, Replikation, Transkription oder Translation des Konkurrenten in Mitleidenschaft gezogen werden. B. subtilis stellt einen bestimmten

    Typus Antibiotika, die sog. Lantionin-haltigen Antibiotika, oder auch: Lantibiotika her. Diese bilden, durch Wechselwirken mit dem Zellwandbestandteil Lipid II, durchlässige Poren in der Cytoplasmamembran Gram-positiver Bakterien, was für den Austritt lebenswichtiger Komponenten um im letzten Schritt den Zusammenbruch des Membranpotentials sorgt. B. subtilis produziert die Lantibiotika Subtilin, Ericin, Sublancin sowie das Peptidantibiotikum Subtilosin, die als Vorläuferpeptide synthetisiert und durch post-translationale Abwandlungen zu aktiven antimikrobiellen Substanzen modifiziert werden. Zum anderen ist B. subtilis in der Lage, bei

    anhaltendem Stress Überdauerungsformen zu bilden. Diese Endosporen sind widerstandsfähig gegen Hitze, Austrocknung, Strahlung und extreme pH-Werte und können sehr lange in einem ruhenden Stadium überdauern. Endosporen entstehen durch inäquale Teilung der Mutterzelle und Auflagerung mehrerer Wandschichten, sie werden unter Lyse der Mutterzelle entlassen und keimen erst bei einer ausreichenden Nährstoffgrundlage aus.

    Im ersten Teil des Versuches (1.1) wird die Produktion von Antibiotika untersucht. Verschiedene B. subtilis Stämme, sowie B. licheniformis werden auf ihre Fähigkeit

    überprüft, Antibiotika zu produzieren. Dies geschieht anhand eines Agar-Diffusionstestes, bei welchem die Teststämme in ca. 2cm Länge auf einer

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    Micrococcus luteus-Indikatorplatte aufgebracht werden. Produzieren genannte Stämme antimikrobiell wirksame Substanzen, hemmen diese das Wachstum von M.

    luteus und Hemmhöfe um die zu untersuchenden Stämme werden sichtbar. Im darauf folgenden Teil des Versuches (1.2) wird die Autoinduktion mittels Subtilin getestet. Subtilin wirkt als Pheromon und induziert die Expression der Subtilin-Biosynthese. Als Autoinduktor wird Subtilin durch eine membranständige Sensor-Histidinkinase erkannt und gebunden. Im nächsten Schritt wird der Histidinrest autophorphoryliert und der Phosphatrest im Anschluss daran auf den Response-Regulator SpaR übertragen. Dieser ist nun aktiviert und sorgt für die Expression der spa-Gene. Der Test erfolgt, indem ein Subtilin-Reporterstamm in Kontakt mit verschiedenen Teststämmen auf einer 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-

    Galactopyranosid (X-Gal)-Platte ausgestrichen wird. Eine auftretende Blaufärbung zeigt die Produktion von Subtilin durch die Teststämme an. Der letzte Abschnitt des ersten Versuchsteils (1.3) dient dazu, die Produktion von Subtilin in Abhängigkeit der Wachstumsphase zu bestimmen. Hierzu werden über einen Zeitraum von acht Stunden hinweg Proben einer Subtilin-Reporterstamm Zellkultur entnommen und anhand der optischen Dichte eine Wachstumskurve erstellt. Zu den einzelnen Zeitpunkten werden zusätzlich Proben entnommen, anhand derer eine

    Subtilinbestimmung durchgeführt wird. Letztere geschieht mit Hilfe einer Reportergenfusion des spa-Promotors mit dem promotorlosen lacZ-Gen. Die durch

    das lacZ-Gen codierte β-Galactosidase hat die Fähigkeit das angebotene Substrat ortho-Nitro-Phenol-Galactose (oNPG) zu spalten. Das resultierende Monomer ortho-Nitro-Phenol weist eine gelbe Färbung auf, die anhand der Messung der optischen Dichte quantifiziert werden kann. Dies lässt Rückschlüsse auf die Promotoraktivität des spaS-Promotors und damit auch auf die Subtilinmenge in der Probe zu. Im zweiten Versuchsteil (2.1) geht es um Zellwandbiosynthesestress induziert durch Lantibiotika und Bacitracin. Ein Bestandteil bakterieller Zellwand ist das sog. Lipid II. Interagiert eine antimikrobielle Substanz mit diesem Komplex, wird ein zwei-Komponenten-System - LiaRS - angesprochen, welches die Expression von Genen - den lia-Genen - induziert. Diese lia-Gene dienen dem Selbstschutz und werden

    darum auch als Resistenzgene bezeichnet. Wird eine Reportergenfusion zwischen dem liaI-Promotor und dem promotorlosen lacZ-Gen vorgenommen, so kann dies

    dem Nachweis von Lipid II-interagierenden Antibiotika dienen. Der, die

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    Reportergenfusion enthaltende, Reporterstamm (Lipid II-Stress-Indikatorstamm) exprimiert bei Lipid II-abhängigem Zellwandbiosynthesestress nebst den lia-Genen

    auch die β-Galactosidase, codiert durch das lacZ-Gen. Die Spaltungsprodukte

    letzteren sind dann ein Indikator dafür, dass Lipid II-interagierende Antibiotika vorhanden sind. Im weiteren Verlauf des Versuches wird die Bacitracin-Konzentration ermittelt, bei der das zwei-Komponenten-System LiaRS reagiert (2.2). Hierzu werden dem Lipid II-Stress-Indikatorstamm verschiedene Bacitracin-Konzentrationen zugesetzt und die Aktivität des liaI-Promotors anhand der Spaltungsprodukte der β-

    Galactosidase ermittelt.

    Einige Bakterienarten sind befähigt in gewissen Stresssituationen (meist Mangel von essenziellen Nährstoffen) Endosporen auszubilden. Die Sporen werden bei dieser Art der Zelldifferenzierung innerhalb der Zelle gebildet, wie bereits der Name

    Endospore verrät. Die Endosporenbildung durchläuft mehrere Stadien (Abb.1), wobei um die Spore mehrere „Hüllen― gebildet werden. In Phase I haben sich beide Kopien des Chromosoms in der Längsachse der Zelle angeordnet. Der entscheidende Schritt jedoch, der zu der Ausbildung der Spore führt, ist die asymmetrische Teilung (Phase II). So entsteht die kleinere Präspore, welche durch das sich bildende Septum von der größeren Muterzelle getrennt wird. In Phase III umwächst der Mutterzellen-Protoplast die Präspore. Dieser Prozess wird auch als „Engulfment“ bezeichnet, das soviel bedeutet, wie Verschlingen oder Einkapselung.

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Abbildung 1: Der Sporulationszyklus von Bacillus subtilis (2)

    Über die Membran der Präspore wird nun nach Außen Peptidoglykan abgegeben und es bildet sich die Sporenrinde (cortex - Phase IV). Die äußere Sporenhülle

    (spore coat Phase V) wird als proteinhaltige Schicht von der Mutterzelle gebildet. In Phase VI und VII kommt es zur Reifung der Spore, sowie zu deren Freisetzung durch Lyse der Mutterzelle. Die dormante Spore ist nun in der Lage über einen längeren Zeitraum, sowie unter lebensfeindlichen Bedingungen, wie hohe Temperaturen, Austrocknung oder gar UV-Bestrahlung, zu überdauern.

    Verbessert sich nach einiger Zeit das Nährstoffangebot, so keimt die Spore aus und steigt wieder in den vegetativen Zellzyklus ein. Verschlechtern sich diese wiederum, so wird ein weiteres Mal der Sporulatonszyklus eingeschlagen.

    Im Gegensatz zu der „normalen― Teilung, in der Mitte der Zelle, wird bei der

    1Sporulation eine erhöhte Ansammlung von FtsZ-Protein, sowie die Synthese von

    dem sporulationsspezifischen Protein SpoIIE beobachtet. Das FtsZ-Protein ist ebenfalls bei der Zellteilung während des vegetativen Wachstums beteiligt, hierbei

     1 FtsZ, auch filamenting temperature sensitive protein Z genannt und ist ein Tubulin Homologon.

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    bildet sich der Z-Ring in der Mitte der Zelle aus. Dieser Ring zeigt die Position der Septumbildung an (siehe Abb. 2).

    Abbildung 2: Zellteilung während des vegetativen Wachstums (a) und Zellteilung während der Sporulation von Bacillus subtilis (b) (2)

    Während der Sporulation kommt es zu einer Umorientierung des Z-Ringes (siehe Abb. 2 - b). Hier positionieren sich zwei separate Ringe an beiden Polen der Zelle, wobei nur einer ausgewählt wird, das Septum zu bilden. Die Umstellung der Position des Z-Ringes ist darauf zurückzuführen, dass es zu einer helikalen Umverteilung des FtsZ-Proteins von der Mitte der Zelle, zu den Zell-Polen kommt.

    2Die Expression der spo-Gene unterliegt einer zeitlichen, als auch räumlichen

    Kontrolle. Die entsprechenden spo-Gene werden nur während der Sporulation gebildet, und das in einer strikt vorgegebenen Reihenfolge. Hinzu kommt, dass diese Gene, entweder in der Mutterzelle oder in der Präspore selbst, exprimiert werden. Demzufolge durchlaufen Mutterzelle, als auch Präspore unterschiedliche Differenzierungsprogramme, wobei alternative Sigmafaktoren (-Faktor) eine

    bedeutende Rolle spielen (siehe Abb. 3)

     2 Die spo-Gene sind die Gene, die für die Sporulation essentiell sind.

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    Abbildung 3: Genexpression innerhalb der Kompartimente, sowie interkompartimentale Signale

    In Abb. 3 ist zunächst erkennbar, dass die beiden Kompartimente miteinander in Verbindung stehen und abwechselnd von Mutterzelle und Präspore verschiedene

    FSignale in Aktion treten. In der Präspore wird der aktiviert und treibt somit die

    GExpression von SpoIIR und an. SpoIIR induziert in der Mutterzelle die

    EEUmwandlung des inaktiven pro-, in die aktive Form über SpoIIGA.

    EK hingegen bewirkt die Expession der inaktive Form pro-, sowie von SpoIIIA,

    345G 6SpoIVFA , SpoIVFB und BofA . wird durch SpoIIIA, über SpoIIIJ, von einem

    noch unbekannten Inhibitor in der Präspore, gelöst und somit aktiviert (in Abb. 3, als

    G„X― gekennzeichnet). Die aktive Form von wiederum, vermittelt die Expression von

    SpoIVB, wobei dieses Protein als Signal zwischen der Präspore und der Mutterzelle dient. Dieses induziert die Trennung des SpoIVFA-BofA-SpoIVFB-Komplexes und

     3 SpoIVFA: Membranprotein 4K SpoIVFB: Membranassoziierte Protease (für -Prozessierung) 5 BofA: Inhibitor für SpoIVFB 6G ist Signal zur Ausschleusung der Protease

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    KK 7 in die aktive Form umgewandelt. mithilfe von SpoIVFB wird der inaktive pro-

    K setzt das Signal zur Lyse der Mutterzelle und die Spore wird freigesetzt (3.1). Die Transformation beschreibt die Fähigkeit freie DNA aufzunehmen. Organismen, die dazu befähigt sind, werden auch als natürlich kompetent bezeichnet. Der Sinn hinter der Aufnahme von Fremd-DNA, ist diese als Erweiterung des eigenen Genoms zu integrieren, oder diese gar zu zersetzen und als Nahrungsquelle zu verwenden. B.

    subtilis ist hinsichtlich der Kompetenz determiniert, so dass die entscheidenden Gene in Stresssituationen induziert werden. Die Ausbildung der Kompetenz ist abhängig von der Wachstumsphase und kann durch ein Umsetzten der B. subtilis-Kultur von

    einem reichhaltigen Medium, in ein Minimal-Medium erlangt werden. Die Transformation beginnt mit der Bindung der DNA an spezifische Proteine den

    Com-Protein-Komlpex. Im Verlauf werden Endonucleasen sekretiert, diese

    fragmentieren die DNA-Moleküle, wobei die DNA-Sequenz unspezifisch ist, so dass die Spaltung in festgelegten Abständen erfolgt (10 kBp bis maximal 20 kBp). Die linearisierten Doppelstränge werden mittels membrangebundener DNA.Bindeproteine in die Zelle eingeschleust, wobei nur ein DNA-Strang aufgenommen wird, der andere wird außerhalb der Zelle nukleolytisch abgebaut. Der aufgenommene Strang wird in das Rezipientengenom eingebaut, wobei die Polarität der DNA nicht relevant ist.

    Die Kompetenz von B. subtilis entsteht in der mittleren bis späten exponentiellen

    -3Wachstumsphase, wobei eine Transformationshäufigkeit von durchschnittlich 10

    erreicht wird (siehe Skript, sowie Folien zur Vorbesprechung).

    In diesem Versuch (4.1-4.3) soll die Fähigkeit von B. subtilis, freie DNA aufzunehmen,

    untersucht werden. Es werden B.subtilis ;spaS-Zellen verwendet. Diese sind nicht

    mehr befähigt Subtilin zu produzieren. Experimentell wird nun untersucht, ob B.

    subtilis durch doppelt homologe Rekombination des SpaS-Gens wieder befähigt wird, dieses Antibiotikum zu synthetisieren.

    Hierbei wird das Plasmid pMB32 zur Hilfe genommen. Es enthält das Strukturgen von Subtilin unter der Kontrolle des spaS-Promotors. Ebenfalls auf dem Plasmid

     7KK ist Signal zur Apoptose, wird in Mutterzelle zuerst in der inaktiven pro- Form synthetisiert und Kdurch Signal seitens der Präspore wird zur aktiven Form umgewandelt.

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    enthalten, sind Resistenzkassetten für Ampicillin und Neomycin, sowie homologe Sequenzen zum Amylase-Genlocus in B. subtilis. Die Amylase wird synthetisiert, um

    Stärke zu Glucose zu hydrolysieren, welche wiederum im Bakterium verwertet werden kann.

    Durch doppelt homologe Rekombination in den AmyE-Locus kann die entsprechende DNA-Sequenzen in das Chromosom von B. subtilis integriert werden, in diesem Fall

    das funktionale spaS, unter Kontollle des spaS-Promotors. Zusätzlich wird die

    Neomycin-Resistenzkassette mit eingebaut (siehe Abb. 4).

    Abbildung 4: Doppelt homologe Rekombination in B. subtilis ATCC 6633 ;spaS

Der Einbau in den Amylase-Genlocus, sowie das Einbringen der

    Neomycinresistenzkassette, kann nun zum einen, bei erfolgter Transformation hinsichtlich der errungenen Neomycinresistenz selektiert werden. Ein weiterer Hinweis zu einer erfolgreichen Transformation, ist darauf zu testen, ob das Bakterium weiterhin in Lage ist das Enzym Amylase zu bilden, und somit ebenso befähigt ist Stärke zu spalten. Ist dies nicht der Fall und das Bakterium zeigt einen

    AmyPhänotyp auf, so ist das Teilstück des Plasmiden durch doppelt homologe Rekombination in das Bakteriumchromosom integriert worden. Zeigt sich jedoch

    +weiterhin ein Amy-Phänotyp, vergleichend zum Wildtyp, so ist der AmyE-Locus weiterhin intakt und es ergeben sich die Möglichkeiten, dass es entweder zu keiner

Abb.4 aus Folien zu der Praktikums-Vorbesprechnung

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